.前言
    白蚁是一种世界性重要害虫。全世界已知白蚁种类有约3000种[1]，我国约400多种[2]，在长江以南地区危害尤为严重。它们与人类经济密切相关，可对人类社会造成较大危害[3-4]。早期传统的形态分类法为白蚁的分类鉴定奠定了基础。白蚁的外部形态相似，目前白蚁主要依靠兵蚁或有翅成虫进行分类[5]。但是在区分一些相似种、近缘种上难度较大，容易引起误判[6-7]。同时，白蚁的形态学分类往往需要一定数量的个体，分类时个体太少则会影响结果的可靠性，而有些白蚁种群的兵蚁很少，这都给白蚁的分类带来了较大的困难。
    基于聚合酶链式反应( Polymerase chainreaction, PCR)技术为物种鉴定提供了新的手段，弥补了传统形态鉴定的诸多不足[8]。该技术通过引物和模板DNA特异性的结合, 可在短时间内扩增出数百万特异DNA序列拷贝。它具有如下几个优点：（1）不受白蚁组织类别、发育阶段等影响。DNA上得到的信息不会随白蚁发育时期的不同而变化。（2）不受环境影响。因为环境只影响基因表达，而不改变基因的核苷酸序列。（3）DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。（4）提取的DNA样品，在低温下可长期保存[9]。因此，近年来分子生物学技术被越来越广泛地应用于白蚁分类研究中。线粒体编码细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ基因（COⅡ）已成为当前动物分子系统中应用最广泛的分子标记[10]。Jenkins等首次利用COⅡ基因序列推断台湾乳白蚁入侵危害的途径[11]。Miura等利用线粒体COⅡ基因和翻译的蛋白质序列对进化较高的白蚁科和鼻白蚁科15个属的系统发育关系进行了研究[12]。
    本研究在广东省范围内采集白蚁标本，并采用基于COⅡ基因部分序列的PCR产物直接测序法鉴别确认白蚁种类，该研究可为今后开展白蚁种群分布和危害调查提供科学基础，从而进一步掌握蚁害发生特点，提高白蚁防治水平。
2.材料和方法
2.1材料和仪器
2.1.1材料和试剂
    一次性组织研磨棒、1.5mL离心管、200μL PCR薄壁管，1000μL、200μL、10μL枪头、上下游引物均购；Takara r-taq 酶（250U）、Takara DL 2000 DNA marker（500μL）购；EasyPure Genomic DNA提取试剂盒、Axygen胶回收试剂盒、Biowest Agarose琼脂糖（100g）。
2.1.2仪器设备
    梯度PCR仪、琼脂糖水平电泳仪、手提紫外分析仪、Fresco 21微型离心机、凝胶成像系统、电子分析天平（0.0001g）、全自动蒸汽高压灭菌锅、移液枪、超级恒温水浴锅。
2.2试验方法
2.2.1白蚁样本采集
    从全广东省范围内，特别是白蚁危害重点区域采集白蚁标本。采集白蚁时，取活体或死亡时间少于24 h的完整成虫体，密封保存于99.9%酒精的样本瓶中，做好标签和记录。
2.2.2白蚁组织基因组DNA提取
    选取白蚁整体为试验材料，用纸巾将样品表面的酒精和水分吸干后，称重，控制样品质量≤25 mg。样品用研磨棒研磨，采用EasyPure Genomic DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA。最后用EB溶液进行两次洗脱，合并两次的洗脱液用于PCR反应的模板。
2.2.3 PCR扩增COⅡ基因部分序列
2.2.3.1引物
    通常用于种群分类分析的基因是16S rRNA、COI、COII、ND1、ND5[2]。本文采用以下引物用于片段扩增：上游引物COⅡ1：5’-CAGATAAGTGCATTGGATTT-3’；下游引物COⅡ2：5’-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’。
2.2.3.2扩增体系
    采用Takara公司生产的PCR试剂盒。反应体系50μL，包括：5μL10×buffer(Mg2+-)，4μLdNTP，3μLMg2+,正反引物各1μL(20 mmol/L)，1μLDNA模板，17μL灭菌超纯水。
PCR反应条件如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环。最后72℃反应10 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并用EB染色。用DNA marker（DL2000）标记扩增片段大小，以确定是否为目的片段。电泳后置于凝胶成像系统观察。
对于有杂质，需要纯化的PCR产物，采用Axygen胶回收试剂盒纯化后测序；对于扩增效果良好的PCR产物则可直接测序。本实验广东生物资源应用研究所进行测序和拼接，每个样品采用正反链双向测序，以提高测序的准确度。
2.2.4数据分析
    根据委托公司发回的测序结果，将正反链拼接得出的碱基序列在NCBI网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上进行BLAST相似性搜索，选择相似度最高的确定为该物种。
3.结果与分析
3.1白蚁标本采集结果
    在广东省范围内，特别是白蚁危害重点区域共收集有效白蚁标本185个。
3.2 PCR扩增结果
    以编号zj144、zj035、zj115、zj102、zj101、zj100、zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、zj092的样品为例，PCR扩增结果见图1。引物对检测样本扩增出800bp左右的条带。结果显示，检测样本的PCR扩增结果与设计目标相同；同时，目标条带明亮清晰，说明PCR扩增特异性较高，效果良好，PCR产物可直接测序。
图1引物PCR扩增图（从左到右条带分别为DNA marker（DL2000）、zj144、zj035、zj115、 zj102、zj101、 zj100、 zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、 zj092）
3.3 测序结果
    以编号zj004的白蚁标本为例，测序后拼接得出的碱基序列如图2所示。将碱基序列在NCBI网站上进行BLAST相似性搜索，结果见图3。结果显示，zj004号样本与台湾乳白蚁这一物种的基因相似度最高，相似度达99%。同时结合形态学特征，确认zj004号样本为台湾乳白蚁。
图2 zj004号白蚁样本拼接碱基序列
4.总结与展望
    本研究在广东省范围内采集白蚁标本185份，经分子生物学方法共鉴定出2科4属7种白蚁。散白蚁所占比例明显高于其他属白蚁，其中黑胸散白蚁比例最高，为该地区优势蚁种。
    随着分子生物学的发展，利用分子生物学技术进行种类鉴别、检测的应用越来越多[13-14]。本文利用分子生物学技术对白蚁种类做出鉴别，无论白蚁何种生物型和虫态，均可用于鉴定；同时需要的样品量少，简便快捷，提取的DNA模板可用于多次检测。但需要注意的是，要防止昆虫标本DNA降解，才能获得可靠准确的遗传信息。相信随着研究的不断深入，实验技术将不断完善和提高。在结合形态学鉴定的基础上，现代分子生物技术正成为白蚁分类鉴定的有力手段，为进一步开展白蚁的分布和危害调查提供更为坚实的科学基础，并为白蚁防治提供新的方法和思路。

                                              广东房安白蚁防治

                                              2017年3月18日